Nature旗下期刊发表gDNA/NgAgo最新报道,韩春雨光棍节复活?

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数月前,河北科技大学韩春雨副教授在Nature Biotechnology上发表基于gDNA/NgAgo系统的基因编辑技术,因其诺奖级的前景,在学术界产生巨大反响。但随后论文因为实验重复性问题在网络、媒体上引起轩然大波。据称,曾有数十家实验室表示无法重复韩的结果,网络上不少人呼吁对韩的实验展开调查。

韩春雨在Nature Biotechnology上发表的基于gDNA/NgAgo的论文

然而就在昨夜,童鞋们在双十一剁手的日子里,Nature集团旗下Cell Research 杂志刊登了一篇关于gDNA/NgAgo的Letter又一次“一石激起千层浪” ,引起关于gDNA/NgAgo的广泛讨论。

基于NgAgo的基因下调导致斑马鱼眼发育缺陷

文章通讯作者是来自南通大学的刘东教授。

刘东教授

南通大学网站上刘东教授的简介

刘东教授的文章中引用韩春雨的论文,指出gDNA/NgAgo系统由于对指导靶标的错配、低脱靶效应以及易于设计等独特优势而引起关注。他们用fabp11a验证gDNA/NgAgo系统是否能用于操纵斑马鱼基因。fabp11a是一个脂肪酸结合蛋白家族成员,在调节葡萄糖和脂质平衡以及炎症反应中起着重要作用。但迄今为止,fabp11a在斑马鱼胚胎发育中的作用仍然不清楚。作者构建了对斑马鱼细胞核定位多肽(NLS)密码子优化的NgAgo来验证5′磷酸化的单链DNA是否能够指导NgAgo破坏斑马鱼内源基因。两条24bp的单链DNA分别靶标于fabp11a基因的二号外显子和三号外显子。

当把上述两种DNA分别和NgAgo-2nls mRNA一起注入斑马鱼单细胞期胚胎30小时后,作者观察到大约30%的斑马鱼胚胎出现了眼部表型异常,要么出现一个小的或者相对正常的眼睛(type1),要么在头顶出现一个独眼龙一样的大的融合眼(type2)。

为了验证这些眼部表型变化是否由fabp11a基因突变引起,作者提取这些胚胎的基因组DNA并对目标区域进行PCR扩增。出乎意料的是,sanger测序并没有发现任何目标区域的DNA序列变化。然而,实时定量PCR却观察到了fabp11a基因表达的下调(图E)。在单独注入NgAgo-2nls mRNA或者gDNA的胚胎,也没有观察到任何特殊的表型(图D),这说明这些表型变化是由gDNA/NgAgo 复合体引起。共注射NgAgo-2nls mRNA和两个独立的错配DNA也不会引起任何眼部发育缺陷,这证明了gDNA/NgAgo系统的特异性。

作者还设计了两个反向gDNAs(RV-guide),和NgAgo-2nls mRNA一起注入斑马鱼胚胎,观察到15%的斑马鱼胚胎眼部发育异常(图D),同样发现fabp11a基因表达下调(图E)。而两条互补的gDNA和NgAgo-2nls mRNA一起注入同样导致眼部表型异常,但没有发现基因插入和缺失。

而这些由gDNA/NgAgo 系统导致的眼部表型异常可以通过共注射  fabp11a mRNA得到缓解(图D)。

为了验证gDNA/NgAgo是否能按照一般原理敲低(knock down)斑马鱼基因,他们还用另外一种和尾部发育相关的ta基因(短尾或者无尾基因)做上述实验,得到结果和fabp11a类似。其他更多的实验(用kdrl , lama1  and flt1)也得到类似的结果。不同长度的靶标fabp11a和ta基因的gDNA (20-27 nt)显示越短的gDNA在两个基因上都表现出越高的敲低效率。

作者还通过原位杂交实验确认,在斑马鱼胚胎发育早期,fabp11a确实是特异性的在眼部区域高水平表达,这说明fabp11a基因在斑马鱼眼部发育中扮演者重要角色。作者用转录封闭的morpholino(PMO技术)敲低fabp11a基因表达,观察到与上述类似的眼部发育缺陷。而gDNA/NgAgo 系统导致的发育异常效率要高于morpholino。

用CRISPR/Cas9系统敲除fabp11a基因,gRNA1 and gRNA2分别引起60% 和42.9%的插入缺失。gRNA1导致30%的眼部发育缺陷,突变胚胎的F1代表现出类似的眼部发育缺陷表示这种突变和眼部表型异常是可遗传的。

NgAgo介导的基因编辑是否还需要其他特定条件呢?因为报道gDNA/NgAgo在人类细胞中,37℃条件下可以产生11.2%-41.3%的插入缺失,温度可能是影响NgAgo酶活性的一个因素,但当温度高于32.5 °C 会导致斑马鱼胚胎发育畸形,作者也发现在37℃条件下有超过一半的斑马鱼胚胎发育异常。作者在37℃条件下进行gDNA/NgAgo injection试验,观察到的38个fabp11a基因导致的眼部发育异常胚胎和50个ta基因导致的无尾胚胎都没有发现插入和缺失。

作者最后的结论,基因敲低(而非基因敲除)是gDNA/NgAgo影响斑马鱼基因功能的主要机理,可能是gDNA/NgAgo结合了靶基因影响了基因转录。因为没有检测到任何基因组水平的突变,使用突变失活的NgAgo的实验结果也支持这一结论。作者认为gDNA/NgAgo为基因下调提供了一种可选策略。

文章虽然没有证明韩春雨的实验结果,但文章的发表仍然为gDNA/NgAgo留下无限的想象空间,后事如何,让我们拭目以待。

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网友评论2

  1. 沙发
    TigerHoods:

    顶你,韩教授,中国科技的进步需要你的不断投入。

    2016-11-12 下午9:11
  2. 这么多重复实验都出结果了,虽然没有直接证伪韩春雨的结果,但一定程度从侧面反映韩的结果可能会存在问题。而韩一直还没发布新的结果,确实让人很担心啊。如果韩的实验结果和结论不对,那对中国学术声誉的影响将是非常大的。

    2016-11-12 下午11:04
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